世界首例！豬怎么長出人腎臟？啥時能移植人體？廣州團(tuán)隊(duì)揭秘

9月7日，中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院（以下簡稱“廣州健康院”）在國際權(quán)威學(xué)術(shù)期刊Cell Stem Cell（《細(xì)胞干細(xì)胞》）發(fā)表封面研究論文，他們在豬體內(nèi)成功培育出人源中期腎臟，是世界范圍內(nèi)首次報(bào)告人源化功能器官異種體內(nèi)培育案例。

這是在中國科學(xué)院“器官重建與制造”戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)的支持下，圍繞人體腎臟的異種再生這一世界級難題，由廣州健康院的賴良學(xué)課題組、潘光錦課題組以及Miguel A. Esteban課題組組成聯(lián)合攻關(guān)團(tuán)隊(duì)，自2017年中旬起開展了5年多的探索。

也正是這一年，1996年出生的女孩王教偉來到廣州健康院進(jìn)入賴良學(xué)課題組，她也是上述論文的第一作者之一。

這5年多的時間，不只是對于剛攻讀的王教偉，整個團(tuán)隊(duì)都在“摸著石頭過河”。

王教偉。

器官移植手術(shù)每年2萬多例

等待移植患者達(dá)30萬

“相較于其他的器官來說，腎臟的臨床需求量更大?！蓖踅虃フf道。

來自黑龍江的王教偉從小喜歡鉆研學(xué)術(shù)，高中時期對生物學(xué)科有極大興趣，本科選擇了生物科學(xué)專業(yè)，畢業(yè)后更是毫不猶豫地選擇了從黑龍江到廣州讀研攻博，“廣州健康院這里給我們配備了健身房、體育場地，除了運(yùn)動，大家基本上都是在搞研究?！?/p>

2017年，王教偉剛來到廣州健康院做本科畢業(yè)設(shè)計(jì)，恰逢該項(xiàng)研究項(xiàng)目啟動。

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國每年開展器官移植手術(shù)的患者2萬多例，而因終末期器官功能衰竭等待移植的患者高達(dá)30萬，供需缺口巨大。其中，腎臟移植需求增長，據(jù)國家衛(wèi)健委公布，2022年110月，腎臟移植10734例，比2021年同期增長了10.53%，另有數(shù)據(jù)顯示，近年來，廣東省每年腎臟移植等待者數(shù)量至少在5000例以上。

器官移植已成為多種終末期疾病的唯一有效治療手段，供體器官嚴(yán)重缺乏卻限制了這一療法在臨床上廣泛應(yīng)用。而且對于終末期腎病患者，腎臟移植是可行情況下的首選治療方案，相比腹膜或血液透析，腎移植在長期存活率、生存質(zhì)量和治療成本等方面均有明顯優(yōu)勢。

“對于無法得到腎源的終末期腎臟疾病患者，他們只能通過透析治療來維持自己的生命，有好多患者在等待腎源的漫長過程中失去了寶貴的生命。而通過血液透析和尿液透析來維持生命的患者，則承受著高昂的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，并且治療效果也不會比移植一個新的器官效果更好?！蓖踅虃フf道，相對于直接移植自體干細(xì)胞，器官移植有自身組成的結(jié)構(gòu)單元，相對來說效果比較好。

但供體器官嚴(yán)重缺乏限制了器官移植在臨床上廣泛應(yīng)用，干細(xì)胞的器官異種動物體內(nèi)培育可能是未來解決這一問題的理想途徑。人通過這種途徑獲得的人源化器官，供體細(xì)胞來源于患者自體，不僅將具有更全面的細(xì)胞類型和更完善的器官結(jié)構(gòu)與功能，而且能有效避免免疫排斥等問題。

不過，這類技術(shù)還存在諸多障礙——人源多能干細(xì)胞的分化能力不足，在異種動物胚胎內(nèi)的生存能力低下、大動物模型提供的器官缺陷生態(tài)位難以形成、異種胚胎嵌合補(bǔ)償技術(shù)體系不完善等，導(dǎo)致從豬體內(nèi)培育人體器官的設(shè)想一直沒有成功。

在經(jīng)過調(diào)研后，聯(lián)合攻關(guān)團(tuán)隊(duì)想首先解決供體器官最為短缺的腎臟，挑戰(zhàn)攻關(guān)從豬體內(nèi)培育人體腎臟器官。

攻關(guān)5年多

終成功獲第1只嵌合豬胎兒

2021年12月20日，攻關(guān)5年多，王教偉特別記得這一天。

天微亮，廣州科學(xué)城內(nèi)，還沒完全習(xí)慣南方的陰冷冬天的王教偉，從廣州健康院的研究生院宿舍出發(fā)，幸而走了兩分鐘左右就能到實(shí)驗(yàn)室，將儀器調(diào)試好，期待著下午。

按照“34周胎齡內(nèi)終止妊娠”的相關(guān)倫理規(guī)定以及國際慣例，這天，1頭25天前移植了豬胚胎的代孕母豬要被終止妊娠，“這次給代孕母豬子宮做B超檢測，看到胎兒存活情況特別好?！?/p>

DsRed熒光標(biāo)記是為了便于直觀的檢測細(xì)胞，研究人員在人干細(xì)胞中定點(diǎn)敲入了表達(dá)DsRed熒光蛋白基因，從而讓干細(xì)胞表達(dá)紅色熒光。因此當(dāng)能從代孕豬胎兒的中腎部位觀察熒光信號時，就說明表達(dá)紅色熒光蛋白的人源細(xì)胞參與了腎臟的形成。

下午5點(diǎn)，代孕豬胎兒被送來實(shí)驗(yàn)室，攻關(guān)團(tuán)隊(duì)在做好一切準(zhǔn)備后，將胎兒放在熒光顯微鏡下觀測，當(dāng)看到腎臟部位那里有一大團(tuán)紅色熒光，“好激動，起了雞皮疙瘩?！?/p>

激動之余，本著科研人員的“嚴(yán)謹(jǐn)態(tài)度”，科研團(tuán)隊(duì)想馬上著手其他的檢測方法，因?yàn)閱我坏臒晒獠蛔阋哉f明它是否真的是人供體細(xì)胞來源，還是要結(jié)合其他很多種檢測的手段。

在隨后大半年的時間里，不只是做25天的培育，還延長到28天的時候才終止妊娠。重復(fù)出現(xiàn)了紅色熒光，這意味著，他們在豬體內(nèi)成功培育出人源中期腎臟，人源化功能器官異種體內(nèi)培育成功了。

最終，共獲得2只胎齡25天，3只胎齡28天的中腎嵌合胎兒，這些胎兒的中腎內(nèi)人源細(xì)胞占比最高可達(dá)70%，人源細(xì)胞參與形成的中腎小管所占比例最高可達(dá)58%。

第1只嵌合豬胎兒。

“每一步都很困難”

新手剛開始操作總把卵弄丟

人源化功能器官異種體內(nèi)培育的操作流程，簡單說就是將人的干細(xì)胞注入到器官發(fā)育缺陷豬胚胎中，再將嵌合胎兒移植到代孕母豬，得到嵌合胎兒。

將人的干細(xì)胞注入到豬胚胎，需要攻關(guān)三個階段，“首先要保證這個供體細(xì)胞可以存活，改造供體細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞的競爭能力，同時提高干細(xì)胞的分化能力。”王教偉進(jìn)一步解釋道，下步就是利用基因編輯工具，在豬胚胎中敲除兩個腎臟發(fā)育的關(guān)鍵基因，產(chǎn)生空缺的腎臟生態(tài)位，干細(xì)胞就會在豬胚胎里往腎臟器官進(jìn)行分化發(fā)育；最后就是在優(yōu)化了嵌合胚胎體系，以及對移植代孕母體時期的探索后，將人的干細(xì)胞注入到豬胚胎成功得到嵌合胎兒。

王教偉則是負(fù)責(zé)在豬胚胎敲除兩個與腎臟發(fā)育的關(guān)鍵基因后，構(gòu)建器官缺陷豬模型；優(yōu)化胚胎補(bǔ)償技術(shù)體系，包括供體人細(xì)胞注射時期，注射數(shù)目，嵌合胚胎培養(yǎng)基等，從而獲得高質(zhì)量的嵌合胚胎用于移植；以及體外的嵌合囊胚、體內(nèi)的嵌合胎兒中人源細(xì)胞貢獻(xiàn)情況及分化情況的檢測等。

“對我來說每一步都很困難。”自2017年考入，5年多的時間，王教偉已記不清失敗過多少次，經(jīng)常會被實(shí)驗(yàn)結(jié)果控制喜怒哀樂，某一次實(shí)驗(yàn)失敗了，這一天心情都會特別沮喪，尤其是在前期摸索階段，“比如說，我剛開始操作胚胎實(shí)驗(yàn)，卵很小，需要在顯微鏡下去操作，操作還不太熟練，總是把卵給弄丟，那時候就感覺自己怎么這么笨，一天都很崩潰很沮喪。”

攻關(guān)的三個階段。

“摸著石頭過河”

移植1800多個胚胎僅獲5個胎兒

這5年的時間，不只是對于剛讀研的王教偉，對于整個科研團(tuán)隊(duì)都在“摸著石頭過河”。

在2021年12月20日之前，聯(lián)合攻關(guān)團(tuán)隊(duì)做過多次實(shí)驗(yàn)，得到的嵌合胎兒都退化了，不是正常的胎兒形態(tài)。

“一枚含有人源細(xì)胞的嵌合胚胎在代孕母豬體內(nèi)發(fā)育成為一個沒有退化的胎兒，是比較困難的?！睋?jù)介紹，“我們首先需要將正常的豬胚胎通過體細(xì)胞核移植技術(shù)，構(gòu)建多基因修飾的腎臟發(fā)育缺陷豬胚胎，經(jīng)過這個過程獲得克隆豬的效率本身就很低。加之，我們還要對這些胚胎再注射一次人源細(xì)胞，并且還要將嵌合胚胎在體外培養(yǎng)24小時。雖然我們會挑出狀態(tài)比較好的胚胎用來移植，但是哪怕是這樣，在移植到代孕豬后，可能也會有大部分胚胎發(fā)育不下去，所以最終獲得的胎兒數(shù)目是很少的。13頭代孕豬移植了1800多個胚胎，這也是為什么最后只在兩頭里獲得5個胎兒?！?/p>

潘光錦課題組多年來致力于人干細(xì)胞異種嵌合障礙機(jī)制的研究，近年來發(fā)現(xiàn)了人干細(xì)胞在異種胚胎發(fā)生凋亡是限制人干細(xì)胞異種嵌合的重要機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)MYCN能通過增強(qiáng)干性及細(xì)胞競爭有效促進(jìn)人干細(xì)胞的異種嵌合，首先實(shí)現(xiàn)小鼠胚胎異種嵌合分離獲得了有一定功能的人源血液細(xì)胞，該成果首次從異種嵌合胚胎成功分離到活的具有一定功能的人源細(xì)胞。

與此同時，Miguel A. Esteban課題組開發(fā)了一種新型干細(xì)胞培養(yǎng)體系，能夠?qū)⑷烁杉?xì)胞的分化能力提高到8細(xì)胞階段的卵裂球狀態(tài)。

王教偉所在的賴良學(xué)課題組借助新型基因編輯工具，結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)及胚胎顯微操作技術(shù)，通過兩輪基因修飾，敲除了調(diào)控輸尿管芽分支的SIX1基因以及后腎間質(zhì)發(fā)育SALL1基因，構(gòu)建了器官生態(tài)位更為充足的中腎發(fā)育缺陷、后腎完全缺失的腎臟缺陷豬模型，為人體腎臟在豬體內(nèi)的發(fā)育創(chuàng)造了適宜的生態(tài)環(huán)境。

研究團(tuán)隊(duì)在賴良學(xué)的帶領(lǐng)下，對人豬胚胎補(bǔ)償技術(shù)體系進(jìn)行了全方位的優(yōu)化，最終確定了理想的胚胎補(bǔ)償技術(shù)流程，即在桑葚到早期囊胚時期注射35個人源供體細(xì)胞，構(gòu)建嵌合胚胎。

嵌合胚胎在等比例混合的胚胎培養(yǎng)基和干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時后，移植入發(fā)情周期同步的代孕母豬，獲得陽性嵌合豬胎兒，最終成功實(shí)現(xiàn)了人源化中腎的異種體內(nèi)再生。

已邁出關(guān)鍵的一步

移植人體還需摸索后期腎臟研究

現(xiàn)在成功在豬體內(nèi)再造出了人體中期腎臟，那么離完全能達(dá)到人體移植還差多少？

在大動物體內(nèi)再生人體中期腎臟，這讓王教偉看到希望，這項(xiàng)研究對于器官移植來說，已邁出了關(guān)鍵的一步，之后可以方便其他的科學(xué)家、專家進(jìn)行下一步優(yōu)化深耕，“但離真正能移植到人的話，其實(shí)還需要一段很長的路要去摸索。”

據(jù)介紹，若要獲得一個成型的，可用于移植的后期腎臟，還有諸多問題有待解決。為了達(dá)到這一目的，還需要對包括干細(xì)胞培養(yǎng)體系、人豬胚胎補(bǔ)償技術(shù)體系以及宿主胚胎等多方面繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化。“對于后腎而言，其腎小球中毛細(xì)血管簇由腎臟間質(zhì)祖細(xì)胞通過血管生成或者現(xiàn)有血管對發(fā)育間充質(zhì)的滲透而來。所以我們下一步科研方向之一就是將同時敲除腎臟和血管的發(fā)育關(guān)鍵基因，讓腎臟和血管同時發(fā)育缺陷，再觀察嵌合豬胎兒腎臟內(nèi)是否能生長出人的血管?！?/p>

除了腎臟，像肝臟和心臟也是目前極其短缺的器官。王教偉還表示，基于我們在功能性實(shí)質(zhì)器官異種體內(nèi)再造邁出的第一步，團(tuán)隊(duì)也正在針對其他器官進(jìn)行探索。

此外，豬的壽命短，人的壽命長，假如能夠在豬里面培養(yǎng)出可移植的腎臟，能夠直接用嗎？據(jù)透露，行業(yè)內(nèi)專家探討過這個問題，利用在豬體內(nèi)再造出的人體腎臟乃至其他器官，理論上，可以用于治療某些患有先天性疾病的嬰兒，“這對臨床來說也是很有意義的。”

采寫：南都記者 李芷琪 受訪者供圖