世界首例！豬怎么長出人腎臟？啥時能移植人體？廣州團隊揭秘

9月7日，中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院（以下簡稱“廣州健康院”）在國際權威學術期刊Cell Stem Cell（《細胞干細胞》）發表封面研究論文，他們在豬體內成功培育出人源中期腎臟，是世界范圍內首次報告人源化功能器官異種體內培育案例。

這是在中國科學院“器官重建與制造”戰略性先導科技專項的支持下，圍繞人體腎臟的異種再生這一世界級難題，由廣州健康院的賴良學課題組、潘光錦課題組以及Miguel A. Esteban課題組組成聯合攻關團隊，自2017年中旬起開展了5年多的探索。

也正是這一年，1996年出生的女孩王教偉來到廣州健康院進入賴良學課題組，她也是上述論文的第一作者之一。

這5年多的時間，不只是對于剛攻讀的王教偉，整個團隊都在“摸著石頭過河”。

王教偉。

器官移植手術每年2萬多例

等待移植患者達30萬

“相較于其他的器官來說，腎臟的臨床需求量更大。”王教偉說道。

來自黑龍江的王教偉從小喜歡鉆研學術，高中時期對生物學科有極大興趣，本科選擇了生物科學專業，畢業后更是毫不猶豫地選擇了從黑龍江到廣州讀研攻博，“廣州健康院這里給我們配備了健身房、體育場地，除了運動，大家基本上都是在搞研究。”

2017年，王教偉剛來到廣州健康院做本科畢業設計，恰逢該項研究項目啟動。

據不完全統計，我國每年開展器官移植手術的患者2萬多例，而因終末期器官功能衰竭等待移植的患者高達30萬，供需缺口巨大。其中，腎臟移植需求增長，據國家衛健委公布，2022年110月，腎臟移植10734例，比2021年同期增長了10.53%，另有數據顯示，近年來，廣東省每年腎臟移植等待者數量至少在5000例以上。

器官移植已成為多種終末期疾病的唯一有效治療手段，供體器官嚴重缺乏卻限制了這一療法在臨床上廣泛應用。而且對于終末期腎病患者，腎臟移植是可行情況下的首選治療方案，相比腹膜或血液透析，腎移植在長期存活率、生存質量和治療成本等方面均有明顯優勢。

“對于無法得到腎源的終末期腎臟疾病患者，他們只能通過透析治療來維持自己的生命，有好多患者在等待腎源的漫長過程中失去了寶貴的生命。而通過血液透析和尿液透析來維持生命的患者，則承受著高昂的醫療負擔，并且治療效果也不會比移植一個新的器官效果更好。”王教偉說道，相對于直接移植自體干細胞，器官移植有自身組成的結構單元，相對來說效果比較好。

但供體器官嚴重缺乏限制了器官移植在臨床上廣泛應用，干細胞的器官異種動物體內培育可能是未來解決這一問題的理想途徑。人通過這種途徑獲得的人源化器官，供體細胞來源于患者自體，不僅將具有更全面的細胞類型和更完善的器官結構與功能，而且能有效避免免疫排斥等問題。

不過，這類技術還存在諸多障礙——人源多能干細胞的分化能力不足，在異種動物胚胎內的生存能力低下、大動物模型提供的器官缺陷生態位難以形成、異種胚胎嵌合補償技術體系不完善等，導致從豬體內培育人體器官的設想一直沒有成功。

在經過調研后，聯合攻關團隊想首先解決供體器官最為短缺的腎臟，挑戰攻關從豬體內培育人體腎臟器官。

攻關5年多

終成功獲第1只嵌合豬胎兒

2021年12月20日，攻關5年多，王教偉特別記得這一天。

天微亮，廣州科學城內，還沒完全習慣南方的陰冷冬天的王教偉，從廣州健康院的研究生院宿舍出發，幸而走了兩分鐘左右就能到實驗室，將儀器調試好，期待著下午。

按照“34周胎齡內終止妊娠”的相關倫理規定以及國際慣例，這天，1頭25天前移植了豬胚胎的代孕母豬要被終止妊娠，“這次給代孕母豬子宮做B超檢測，看到胎兒存活情況特別好。”

DsRed熒光標記是為了便于直觀的檢測細胞，研究人員在人干細胞中定點敲入了表達DsRed熒光蛋白基因，從而讓干細胞表達紅色熒光。因此當能從代孕豬胎兒的中腎部位觀察熒光信號時，就說明表達紅色熒光蛋白的人源細胞參與了腎臟的形成。

下午5點，代孕豬胎兒被送來實驗室，攻關團隊在做好一切準備后，將胎兒放在熒光顯微鏡下觀測，當看到腎臟部位那里有一大團紅色熒光，“好激動，起了雞皮疙瘩。”

激動之余，本著科研人員的“嚴謹態度”，科研團隊想馬上著手其他的檢測方法，因為單一的熒光不足以說明它是否真的是人供體細胞來源，還是要結合其他很多種檢測的手段。

在隨后大半年的時間里，不只是做25天的培育，還延長到28天的時候才終止妊娠。重復出現了紅色熒光，這意味著，他們在豬體內成功培育出人源中期腎臟，人源化功能器官異種體內培育成功了。

最終，共獲得2只胎齡25天，3只胎齡28天的中腎嵌合胎兒，這些胎兒的中腎內人源細胞占比最高可達70%，人源細胞參與形成的中腎小管所占比例最高可達58%。

第1只嵌合豬胎兒。

“每一步都很困難”

新手剛開始操作總把卵弄丟

人源化功能器官異種體內培育的操作流程，簡單說就是將人的干細胞注入到器官發育缺陷豬胚胎中，再將嵌合胎兒移植到代孕母豬，得到嵌合胎兒。

將人的干細胞注入到豬胚胎，需要攻關三個階段，“首先要保證這個供體細胞可以存活，改造供體細胞，增強細胞的競爭能力，同時提高干細胞的分化能力。”王教偉進一步解釋道，下步就是利用基因編輯工具，在豬胚胎中敲除兩個腎臟發育的關鍵基因，產生空缺的腎臟生態位，干細胞就會在豬胚胎里往腎臟器官進行分化發育；最后就是在優化了嵌合胚胎體系，以及對移植代孕母體時期的探索后，將人的干細胞注入到豬胚胎成功得到嵌合胎兒。

王教偉則是負責在豬胚胎敲除兩個與腎臟發育的關鍵基因后，構建器官缺陷豬模型；優化胚胎補償技術體系，包括供體人細胞注射時期，注射數目，嵌合胚胎培養基等，從而獲得高質量的嵌合胚胎用于移植；以及體外的嵌合囊胚、體內的嵌合胎兒中人源細胞貢獻情況及分化情況的檢測等。

“對我來說每一步都很困難。”自2017年考入，5年多的時間，王教偉已記不清失敗過多少次，經常會被實驗結果控制喜怒哀樂，某一次實驗失敗了，這一天心情都會特別沮喪，尤其是在前期摸索階段，“比如說，我剛開始操作胚胎實驗，卵很小，需要在顯微鏡下去操作，操作還不太熟練，總是把卵給弄丟，那時候就感覺自己怎么這么笨，一天都很崩潰很沮喪。”

攻關的三個階段。

“摸著石頭過河”

移植1800多個胚胎僅獲5個胎兒

這5年的時間，不只是對于剛讀研的王教偉，對于整個科研團隊都在“摸著石頭過河”。

在2021年12月20日之前，聯合攻關團隊做過多次實驗，得到的嵌合胎兒都退化了，不是正常的胎兒形態。

“一枚含有人源細胞的嵌合胚胎在代孕母豬體內發育成為一個沒有退化的胎兒，是比較困難的。”據介紹，“我們首先需要將正常的豬胚胎通過體細胞核移植技術，構建多基因修飾的腎臟發育缺陷豬胚胎，經過這個過程獲得克隆豬的效率本身就很低。加之，我們還要對這些胚胎再注射一次人源細胞，并且還要將嵌合胚胎在體外培養24小時。雖然我們會挑出狀態比較好的胚胎用來移植，但是哪怕是這樣，在移植到代孕豬后，可能也會有大部分胚胎發育不下去，所以最終獲得的胎兒數目是很少的。13頭代孕豬移植了1800多個胚胎，這也是為什么最后只在兩頭里獲得5個胎兒。”

潘光錦課題組多年來致力于人干細胞異種嵌合障礙機制的研究，近年來發現了人干細胞在異種胚胎發生凋亡是限制人干細胞異種嵌合的重要機制，并發現MYCN能通過增強干性及細胞競爭有效促進人干細胞的異種嵌合，首先實現小鼠胚胎異種嵌合分離獲得了有一定功能的人源血液細胞，該成果首次從異種嵌合胚胎成功分離到活的具有一定功能的人源細胞。

與此同時，Miguel A. Esteban課題組開發了一種新型干細胞培養體系，能夠將人干細胞的分化能力提高到8細胞階段的卵裂球狀態。

王教偉所在的賴良學課題組借助新型基因編輯工具，結合體細胞核移植技術及胚胎顯微操作技術，通過兩輪基因修飾，敲除了調控輸尿管芽分支的SIX1基因以及后腎間質發育SALL1基因，構建了器官生態位更為充足的中腎發育缺陷、后腎完全缺失的腎臟缺陷豬模型，為人體腎臟在豬體內的發育創造了適宜的生態環境。

研究團隊在賴良學的帶領下，對人豬胚胎補償技術體系進行了全方位的優化，最終確定了理想的胚胎補償技術流程，即在桑葚到早期囊胚時期注射35個人源供體細胞，構建嵌合胚胎。

嵌合胚胎在等比例混合的胚胎培養基和干細胞培養基中培養24小時后，移植入發情周期同步的代孕母豬，獲得陽性嵌合豬胎兒，最終成功實現了人源化中腎的異種體內再生。

已邁出關鍵的一步

移植人體還需摸索后期腎臟研究

現在成功在豬體內再造出了人體中期腎臟，那么離完全能達到人體移植還差多少？

在大動物體內再生人體中期腎臟，這讓王教偉看到希望，這項研究對于器官移植來說，已邁出了關鍵的一步，之后可以方便其他的科學家、專家進行下一步優化深耕，“但離真正能移植到人的話，其實還需要一段很長的路要去摸索。”

據介紹，若要獲得一個成型的，可用于移植的后期腎臟，還有諸多問題有待解決。為了達到這一目的，還需要對包括干細胞培養體系、人豬胚胎補償技術體系以及宿主胚胎等多方面繼續進行優化。“對于后腎而言，其腎小球中毛細血管簇由腎臟間質祖細胞通過血管生成或者現有血管對發育間充質的滲透而來。所以我們下一步科研方向之一就是將同時敲除腎臟和血管的發育關鍵基因，讓腎臟和血管同時發育缺陷，再觀察嵌合豬胎兒腎臟內是否能生長出人的血管。”

除了腎臟，像肝臟和心臟也是目前極其短缺的器官。王教偉還表示，基于我們在功能性實質器官異種體內再造邁出的第一步，團隊也正在針對其他器官進行探索。

此外，豬的壽命短，人的壽命長，假如能夠在豬里面培養出可移植的腎臟，能夠直接用嗎？據透露，行業內專家探討過這個問題，利用在豬體內再造出的人體腎臟乃至其他器官，理論上，可以用于治療某些患有先天性疾病的嬰兒，“這對臨床來說也是很有意義的。”

采寫：南都記者 李芷琪 受訪者供圖