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前沿拓展：

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精品文章

本課題擬采用ANIT誘導(dǎo)IC模型，探討甘草水煎液對IC模型小鼠肝損傷的防治作用及其機(jī)制，為臨床使用甘草水煎液治療IC提供依據(jù)。

甘草水煎液對α萘異硫氰酸酯誘導(dǎo)的肝內(nèi)膽汁淤積性損傷的防治及其機(jī)理研究

沈淑嬌，張志榮，張林林，樊玉娟，譚波，李玥，蔣健，裘福榮

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，臨床藥代動力學(xué)實(shí)驗(yàn)室，上海201203

【摘要】目的：探討甘草水煎液對α萘異硫氰酸酯( ANIT)所致肝內(nèi)膽汁淤積癥(IC)模型小鼠肝損傷的防治作用。方法：雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、甘草低劑量組(1. 13 g·kg1·d1)、甘草中劑量組(2.25 g·kg1·d1)及甘草高劑量組(4. 50 g·kg1·d1)，連續(xù)給藥10 d，檢測總膽紅素( TBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶( AST)及堿性磷酸酶(ALP)水平，HE染色觀察肝臟病理，用LCMS/MS測定血漿膽汁酸含量，RTPCR檢測孕烷受體、細(xì)胞色素P450 3A11、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1和膽酸鹽外排泵。結(jié)果：與模型組相比，甘草低、中劑量組ALT、AST和ALP有下降趨勢；甘草高劑量組ALT、AST和ALP水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，血漿CA濃度在甘草低、中、高劑量分別減少32. 2%、55. 1%和84.4%；血漿CDCA濃度在高劑量減少45. 8%；血漿DCA濃度在甘草低、中、高劑量分別減少49. 1%、52. 5%和67. 1%；血漿LCA濃度在甘草低、中、高劑量分別減少59. 5%、59. 5%和56. 7%。甘草水煎液可增加孕烷受體、細(xì)胞色素P450 3A11、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1和膽酸鹽外排泵的mRNA轉(zhuǎn)錄(P<0.05)，并呈劑量依賴性。結(jié)論：甘草水煎液可促進(jìn)膽汁酸代謝和排泌，減輕膽汁酸負(fù)荷，對IC肝損傷起防治作用。

【關(guān)鍵詞】甘草水煎液；肝內(nèi)膽汁淤積癥；孕烷受體；防治機(jī)制

肝內(nèi)膽汁淤積癥（intrahepatic cholestasis，IC）是由肝細(xì)胞及毛細(xì)膽管膽汁細(xì)胞損害，膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，膽汁流動異常等相關(guān)機(jī)制[1][24][57][89]

1 材料與方法1.1 藥品及試劑

甘草購于上海康橋中藥飲片有限公司，批號：131231，經(jīng)徐德生教授確定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根；ANIT，批號：101458025，購于美國SigmaAldrich公司；肝素鈉注射液（國藥準(zhǔn)字：H31022051，2mL: 12 500單位）購于上海第一生化藥業(yè)有限公司；其他化學(xué)試劑（如甲醛、磷酸二氫鈉、十二水磷酸氫二鈉等）均為國產(chǎn)分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用植物油為初榨橄欖油，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器

4000 QTrap LCMS/MS系統(tǒng)（美國ABI/SCIEX公司），LC20AD液相色譜（日本SHIMADZU公司），IKAwerkeTyp VX2E震蕩器（德國IKA公司），Allegra 64R型低溫高速離心機(jī)（美國Beckman公司），AB135S型分析天平（瑞士METTLER公司），DirectQ3純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.3 動物

C57BL/6小鼠，雌性，SPF級，6周齡，40只，體質(zhì)量20~22g，由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，許可證號：SCXK(滬)2013 0016，在上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心的普通環(huán)境中飼養(yǎng)，并適應(yīng)性飼養(yǎng)2周。

1.4 甘草水煎液的制備

甘草按《中國藥典》2010年版一部規(guī)定的臨床劑量并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)按體表面積換算成小鼠劑量，分為低、中、高3組，分別對應(yīng)正常成人7.5、15、30 g/d的用量。稱重后加入10倍量去離子水，浸泡60 min，加熱回流2次，每次1 h，濾過后合并提取液，離心取上清并減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，分別濃縮至按生藥量計(jì)為0. 056、0. 113、0.225 g/mL，置于4℃冰箱，待用。制得的甘草水煎液以主要成分甘草酸進(jìn)行了液相色譜定量，低、中、高劑量組甘草水煎液中甘草酸含量分別為0. 46、0.92、1.84 mg/mL。

1.5 造模藥物的制備

精密稱取ANIT 200 mg，溶于20 mL植物油中，充分混勻溶解制成濃度為10 mg/mL的油溶液，置于4℃冰箱，待用。

1.6 實(shí)驗(yàn)動物給藥方案

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5組，分別為正常組(N)、模型組(M)、甘草低劑量組(GCL，1.13 g·kg1·d1)、甘草中劑量組(GCM，2.25g·kg1·d1)及甘草高劑量組( GCH，4.50 g·kg1·d1)。給藥階段，每天稱重并計(jì)算給藥體積(0.4 mL/20g)，每天1次，共10 d。其中甘草低劑量組、甘草中劑量組及甘草高劑量組藥液水浴溫?zé)岷蠊辔附o藥，正常組及模型組則給予同體積生理鹽水。除正常組外，其余各組于第7天、第10天在給藥1h后再次給予ANIT油溶液(100 mg/kg，按0.2 mL/20 g)造模，正常組則給予等體積的空白油溶液。末次給藥后，禁食不禁水，12 h后進(jìn)行取材。

摘眼球取血，分裝肝素抗凝管和不抗凝管，10 000 r/min離心10 min分離血漿和血清，置于 80℃保存?zhèn)溆谩７蛛x肝臟，肝臟經(jīng)生理鹽水漂洗后，部分肝左葉切片包埋，于10%中性福爾馬林溶液中固定備用，其余肝組織裝入EP管于80℃保存?zhèn)溆谩?/p>1.7 小鼠血清生化學(xué)檢測

小鼠血清樣本于37℃解凍，分別取適量體積送至上海曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行總膽紅素( TBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶( AST)及堿性磷酸酶(ALP)的檢測。

1.8 肝臟病理形態(tài)學(xué)觀察

肝臟病理切片制備及HE染色均由上海中醫(yī)藥大學(xué)組織病理實(shí)驗(yàn)室完成。

1.9 血漿膽汁酸檢測

將小鼠血漿樣品于37℃解凍，振蕩混勻，取25 μL于1.5 mL離心管中，加入含內(nèi)標(biāo)D5 LCA的乙腈溶液(30 ng/mL) 100μL，渦旋3 min混勻，10 000 r/min離心10 min，吸取80 μL上清至進(jìn)樣瓶中供LCMS/MS分析[10]。檢測血漿CA、GDCA、CDCA、DCA、LCA、TCA、TCDCA、TDCA、GCA、GCDCA等膽汁酸。

空白血漿處理：小鼠血漿加入適量活性炭(100 mg/mL)[1112]后，振搖1h以吸附內(nèi)源性膽汁酸，10 000 r/min離心10 min去除活性炭備用。

1.10 RTPCR檢測

按如下操作執(zhí)行：(1)RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄：利用TAKARA RNAiso提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：PrimeScriptTM buffer 2μL, PrimeScriptTM RT Enzyme Mix lμL, Random 6 mers 2μL,Total RNA 500 ng, RNase Free dH2O 10μL。反轉(zhuǎn)錄條件：將10 μL反應(yīng)體系放入PCR儀中，37℃1h，然后85℃5 s，得到的產(chǎn)物為cDNA，20℃保存。(2)引物設(shè)計(jì)和合成：SYBR和Taqman兩種不同的引物。SYBR引物序列：PXR（NM010936.3，正向引物序列CCTACATGTTCAAGGGCGTC反向引物序列TGCACATCTCAAAAGTGGCC)，CYP3A11（NM007818.3，正向引物序列AGCTCTCTCACTGGAAACCT反向引物序列 AGGTTTGGGCCCAGGAATT），BSEP（NM021022.3，正向引物序列CTCAGCTGCATGACTTCGTC反向引物序列AGGATCTCGTACAATGGCCC)，Gapdh（NM008084.2，正向引物序列AGGTCGGTGTGAACGGATTTG反向引物序列TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA);Taqman引物：UGT1A1 （Mm02603337ml） 和Gapdh（Mm99999915）購買于lifetech。反應(yīng)體系：2×SYBRTM buffer 10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.6 μL，下游引物（10 μmol/L）0.6 μL，cDNA 2μL，ddH2O 6.8μL。反應(yīng)程序：50℃2min，5℃10 min，95℃15 s，60℃30 s 40個循環(huán)，95℃15s，60℃60 s，95℃15 s。上機(jī)分析（3管重復(fù)），以2△△Ct表示目的基因mRNA相對表達(dá)量，△△Ct=（Ct目的基因 CtGAPDH）實(shí)驗(yàn)組(Ct目的基因CtGAPDH)對照組。

1.11 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用方差分析( ANOVA)比較5組間是否存在差異，再用Dunnettt檢驗(yàn)比較模型組與正常組、甘草低劑量組、甘草中劑量組及甘草高劑量組之間的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0. 05。

2 結(jié)果2.1 各組小鼠的一般情況

正常組小鼠狀態(tài)良好，毛色正常，尿液澄清微黃，體質(zhì)量穩(wěn)定增加。模型組小鼠在第一次造模后出現(xiàn)頭頂和背部掉毛；體質(zhì)量減輕，行動遲緩，尿黃。3組給藥組小鼠造模后體質(zhì)量也減輕，行動遲緩，未出現(xiàn)掉毛現(xiàn)象。小鼠處死后打開腹腔，其中模型組小鼠腹腔內(nèi)明顯變黃，肝臟色澤泛白，有膽栓壞死顆粒，膽囊明顯擴(kuò)大；甘草治療組膽栓壞死顆粒明顯減少，肝臟柔韌無泛白，膽囊大小正常。

2.2 各組小鼠的肝臟病理

正常組、模型組和治療組肝臟病理見圖1。正常組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞呈索狀排列，整齊有序，無壞死及變性，肝竇無擴(kuò)張，毛細(xì)膽管無淤膽，匯管區(qū)未見炎性細(xì)胞浸潤，膽管結(jié)構(gòu)正常；模型組肝細(xì)胞混濁腫脹出現(xiàn)大量空泡壞死，可見漿液壞死灶，匯管區(qū)有炎性細(xì)胞浸潤；甘草治療小鼠肝細(xì)胞的壞死程度有所改善，甘草低劑量組可見漿液壞死灶，未見細(xì)胞空泡壞死。中、甘草高劑量組未見明顯壞死灶，肝細(xì)胞形態(tài)排列均正常，匯管區(qū)有炎性細(xì)胞浸潤。

2.3 各組小鼠的肝功能

正常組、模型組、甘草水煎液治療組的TBIL、ALT、AST、ALP水平見表1。與正常組相比，模型組、甘草水煎液治療組血漿TBIL含量明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，甘草低、中、高劑量組TBIL含量差異皆無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

與正常組相比，模型組、甘草低、中、高劑量組小鼠血漿ALT水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，甘草低、中劑量組ALT有下降趨勢，甘草高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常組相比，模型組、甘草治療組小鼠血漿AST水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，甘草低、中劑量組AST有下降趨勢，甘草高劑量組AST水平下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

與正常組相比，模型組、甘草治療組小鼠血漿ALP水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，甘草低、中劑量組ALP有下降趨勢，甘草高劑量組可明顯降低ALP水平(P<0.05)。

2.4 各組小鼠的血漿膽汁酸濃度

血漿膽汁酸的檢測結(jié)果見圖2。小鼠血漿膽汁酸主要以牛磺酸結(jié)合型(T)及游離型為主，甘氨酸結(jié)合型(G)膽汁酸除GCA外均檢測不到。模型組CA、GCA、TCA、TCDCA和TDCA較正常組分別提高4.2倍、63.2倍、870.1倍、502.3倍、4.2倍，而模型組次級膽汁酸DCA、LCA較正常組有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示模型組體內(nèi)膽汁酸明顯淤積。與模型組比較，CA在甘草低、中、高劑量分別減少32. 2%、55. 1%和84. 4%；CDCA在甘草低、中劑量組無明顯減少，而高劑量減少45. 8%；DCA在甘草低、中、高劑量分別減少49. 1%、52. 5%和67. 1%；LCA在甘草低、中、高劑量分別減少59. 5%、59.5%和56. 7%。與模型組比較，結(jié)合膽汁酸(GCA、TCA、TCDCA和TDCA)在甘草低、中、高劑量組減少無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.5 甘草水煎液對相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

PXR、CYP3A11、UGT1A1和BSEP mRNA轉(zhuǎn)錄結(jié)果見圖3。從圖中可以看出：與正常組相比，模型組的PXR、CYP3A11、UGT1A1和BSEP mRNA轉(zhuǎn)錄升高。與模型組相比，甘草水煎液對PXR、CYP3A11、UGT1A1和BSEP mRNA的轉(zhuǎn)錄升高有顯著意義(P<0.05)。

3 結(jié)論

ANIT是經(jīng)典的造模藥物，在體內(nèi)經(jīng)P450代謝后與谷胱甘肽結(jié)合，可引起嚴(yán)重的膽管上皮細(xì)胞壞死，伴有膽管周圍嗜中性粒細(xì)胞浸潤，引起肝內(nèi)膽管增生，從而造成膽管阻塞，引起肝內(nèi)膽汁淤積[14]，現(xiàn)已廣泛用于肝內(nèi)膽汁淤積的研究[1516]。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠膽囊明顯擴(kuò)張，胃腸道呈灰白色，肝臟病理提示膽管上皮細(xì)胞水腫、細(xì)胞間隙增大，伴有炎性細(xì)胞浸潤，膽管管腔變窄，肝細(xì)胞明顯空泡壞死。與正常組相比，模型組小鼠的肝功能指標(biāo)ALT、AST、ALP和TBIL水平明顯升高(P<0.05)，模型組CA、GCA、TCA、TCDCA和TDCA較正常組分別提高4.2倍、63.2倍、870.1倍、502.3倍、4.2倍，提示模型組體內(nèi)膽汁酸明顯淤積，提示肝內(nèi)膽管淤積模型制造成功。模型組次級膽汁酸DCA、LCA較正常組有所下降。因?yàn)镈CA、LCA在小腸中由CA和CDCA經(jīng)腸道細(xì)菌的7α去羥基酶催化生成而來。模型組膽管阻塞，CA和CDCA排泌至小腸中減少，則DCA、LCA產(chǎn)生減少。與模型組相比，甘草低劑量組、中劑量組對肝功能( ALT、AST、ALP)有改善趨勢，甘草高劑量組對肝功能改善作用明顯：ALT、AST、ALP水平明顯降低(P<0.05)，肝臟病理提示肝細(xì)胞壞死明顯改善。甘草水煎液對膽汁淤積小鼠肝損傷具有一定的保護(hù)作用，隨著劑量增加肝損傷保護(hù)作用明顯增強(qiáng)。

肝細(xì)胞的膽汁酸主要由CYP450酶羥基化后增強(qiáng)親水性。CYP3A是主要介導(dǎo)膽汁酸羥基化酶，主要受PXR調(diào)控。膽汁酸在正常生理狀態(tài)多與牛磺酸或甘氨酸結(jié)合后經(jīng)膽管排出。膽汁淤積時(shí)則更偏向于與葡萄糖醛酸基團(tuán)結(jié)合，通過外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白排出肝細(xì)胞。尿苷葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶類UGTs在膽汁淤積時(shí)表達(dá)增加，促進(jìn)膽汁酸代謝；淤積的膽汁酸可通過肝細(xì)胞膽管側(cè)的BSEP泵入膽管。UGTs和BSEP還受PXR核受體部分調(diào)控[17]。

結(jié)果提示甘草水煎液誘導(dǎo)小鼠PXR、CYP3A11、UGT1A1和BSEP的mRNA轉(zhuǎn)錄，并有劑量依賴性。CYP3A11、UGT1A1是PXR下游靶基因，PXR對BSEP誘導(dǎo)也有促進(jìn)作用。CYP3A11和UGT1A1被誘導(dǎo)后可促進(jìn)膽汁酸的代謝，BSEP被誘導(dǎo)可促進(jìn)膽汁酸經(jīng)膽排泄[17]。膽汁酸分游離膽汁酸和結(jié)合膽汁酸，游離膽汁酸包括初級膽汁酸(CA、CDCA)和次級膽汁酸( DCA、LCA)。CA、CDCA、DCA、LCA極性弱，肝毒性較強(qiáng)。與模型組比較，CA在甘草低、中、高劑量分別減少32. 2%、55. 1%和84. 4%；CDCA在高劑量減少45. 8%；DCA在甘草低、中、高劑量分別減少49. 1%、52. 5%和67. 1%；LCA在甘草低、中、高劑量分別減少59. 5%、59.5%和56. 7%。游離膽汁酸減少，肝毒性也會減輕。推測CA、CDCA、LCA可能被CYP3A11和UGT1A1代謝和BSEP排泌。與模型組比較，結(jié)合膽汁酸(GCA、TCA、TCDCA和TDCA)在治療組改變不大，這些結(jié)合膽汁酸水溶性增大，肝毒性相對較小。

本研究提示甘草水煎液可能通過降低膽汁淤積小鼠的肝內(nèi)膽汁酸負(fù)荷，對IC肝損傷起防治作用。

參考文獻(xiàn)【略】

拓展知識：

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1、市場容量是指在不考慮產(chǎn)品價(jià)格或供應(yīng)商的策略的前提下市場在一定時(shí)期內(nèi)能夠吸納某種產(chǎn)品或勞務(wù)的單位數(shù)目.所以國際市場容量實(shí)際上就相當(dāng)于需求量。2、市場占有率就是指你的產(chǎn)品在這個數(shù)據(jù)里面的比例。市場容量趨勢即是在一定時(shí)間內(nèi)是漲還是跌，用數(shù)據(jù)形容。 本回答被提問者采納

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《SYB創(chuàng)業(yè)計(jì)劃書》市場容量或本企業(yè)預(yù)計(jì)市場占有率：

1、市場容量是指在不考慮產(chǎn)品價(jià)格或供應(yīng)商的策略的前提下市場在一定時(shí)期內(nèi)能夠吸納某種產(chǎn)品或勞務(wù)的單位數(shù)目. 所以國際市場容量實(shí)際上就相當(dāng)于需求量。

2、市場占有率就是指你的產(chǎn)品在這個數(shù)據(jù)里面的比例。市場容量趨勢即是在一定時(shí)間內(nèi)是漲還是跌，用數(shù)據(jù)形容。

怎么測算市場容量：

1、 參照去年業(yè)績總量和你通過各種渠道，了解你們行業(yè)內(nèi)同類產(chǎn)品的銷售量，這個數(shù)字是有的，但是不一定精確，但是你用心了也不會偏離太多。

2、 以上的數(shù)據(jù)會有遺漏，主要是即使你獲得所有的銷售量這個精確數(shù)字，也不代表是行業(yè)真實(shí)的需求。

3、所以，你需要根據(jù)行業(yè)裝備的更新速度和下游終端產(chǎn)品的銷售形勢和種類來判斷完整程度。至于具體怎么玩，這個是收費(fèi)項(xiàng)目。

4、 產(chǎn)品迭代和行業(yè)變革影響系數(shù)。這是關(guān)于產(chǎn)能和產(chǎn)品在實(shí)際應(yīng)用中的發(fā)展空間，為你公司研發(fā)和在一些投標(biāo)之前結(jié)盟客戶、屏蔽對手提供可靠依據(jù)。

5、一般我做市場調(diào)研后用數(shù)學(xué)模型來表達(dá)。

6、 行業(yè)內(nèi)競爭對手設(shè)備現(xiàn)場應(yīng)用情況。懂這個產(chǎn)品為什么會壞，這是工藝還是設(shè)計(jì)問題，對于壞的產(chǎn)品和頻率，客戶如何反饋，反饋的結(jié)果是產(chǎn)品更新或者換代的依據(jù)。

7、不要輕視任何一個使用競爭對手產(chǎn)品的客戶，他們都可能形成二次甚至多次成交，并且，可能成為鐵桿。先入為主這個概念，有時(shí)候不一定對，需要看環(huán)境變量。

8、 以上數(shù)據(jù)綜合之后。才對整個產(chǎn)品或者設(shè)備，有基本的認(rèn)識。接下來才是市場。

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